Denník N

Umelé enzýmy: ako uplatňujeme Darwinovu evolúciu v neživej chémii

Martina Ribar Hestericová (vľavo) s kolegyňou pri práci v laboratóriu univerzity v Bazileji. Foto – Martina Ribar Hestericová
Martina Ribar Hestericová (vľavo) s kolegyňou pri práci v laboratóriu univerzity v Bazileji. Foto – Martina Ribar Hestericová

Umelé enzýmy pripravujeme ako prijateľnejšiu alternatívu k priemyselným procesom, ale aj ako jeden z prvých krokov na ceste za umelým životom.

Vonku je ešte tma a ja už otváram dvere do laboratória. Prišla som naschvál skôr, aby som mohla využiť prístroj na meranie fluorescencie ako prvá a nemusela sa oň deliť.

Čaká ma náročný týždeň, okrem učenia sa a účasti na množstve seminárov a prednášok musím totiž dokončiť posledné experimenty potrebné pre ďalšiu publikáciu, ktorú chceme čoskoro poslať na recenziu.

Takto vyzerá takmer každý týždeň strávený vo výskumnej skupine Thomasa Warda na univerzite vo švajčiarskom Bazileji. Už vyše štyri roky tu pracujem na vývoji takzvaných umelých metaloenzýmov a ich použití v nanoaplikáciách.

Ide o tému, ktorá si vyžaduje znalosti organickej, anorganickej a analytickej chémie, biochémie, molekulárnej biológie a nanovied.

Umelé enzýmy

Príprava umelých enzýmov predstavuje neľahkú úlohu. Aby sme ich mohli testovať v chemických reakciách, potrebujeme vyprodukovať veľa mutantov naraz (veľa druhov toho istého enzýmu, ktoré obsahujú nejakú mutáciu), navyše v dostatočne veľkom množstve.

S mojimi kolegami sme preto minulý rok vyvinuli metódu, ktorá uľahčuje skríning našich enzýmov a výrazne znižuje čas a materiál potrebný na výskum. Výsledky sme publikovali v roku 2016 v časopise Nature Protocols.

Vďaka našej metóde som v jednom zo svojich projektov pripravila niekoľko nových generácií umelých metaloenzýmov. Výsledkom sú dva výrazne lepšie mutanty, ktoré by mohli nájsť uplatnenie aj v priemysle.

Pred pár dňami mi o mojom výskume vyšiel článok v prestížnom vedeckom žurnále Angewandte Chemie Internatinal Edition.

Súhra biológie a chémie

Umelé metaloenzýmy, teda enzýmy, ktoré vo svojej štruktúre obsahujú aj atómy kovov, pripravujeme kombináciou biológie a chémie. Zložené sú z bielkoviny, ktorá predstavuje biologickú zložku. V našom prípade ide o bielkovinu s názvom streptavidín.

Aby sme z tejto bielkoviny pripravili umelý enzým, vkladáme do jeho aktívneho miesta kovový katalyzátor, ktorý predstavuje chemickú zložku. Vďaka tomuto katalyzátoru dokáže výsledný umelý enzým katalyzovať rôzne chemické reakcie, vrátane tých, ktoré by v prírode inak neprebiehali.

Keďže sa tieto hybridné enzýmy skladajú z biologickej aj chemickej zložky, ich aktivita sa dá vylepšiť dvoma spôsobmi: chemickým spôsobom, teda zmenou štruktúry katalyzátora, alebo naopak, biologickým spôsobom, čiže zavedením genetických mutácií v bielkovine.

Biochemickí Rómeo a Júlia

Streptavidín sme si na naše experimenty nevybrali náhodou. Táto bielkovina, ktorá sama osebe nemá schopnosť katalyzovať reakcie, má jednu veľmi zaujímavú vlastnosť. Dokáže veľmi silne viazať molekuly vitamínu B7 známeho aj ako biotín.

Interakcia medzi streptavidínom a biotínom je natoľko silná, že ide o jednu z najsilnejších nekovalentných interakcií v prírode. Technológia streptavidín-biotín sa preto používa v rôznych oblastiach vedy, od nanotechnológií cez medicínu až po zobrazovacie techniky či proteomiku (skúmanie proteínov a ich vlastností).

V Bazileji využívame túto silnú interakciu inak. Molekuly biotínu najprv upravíme tak, aby na sebe mali pripevnený katalyzátor. Takto zabezpečíme, že kalatyzátor ostane pevne ukotvený v streptavidíne.

Výsledkom je umelý enzým, v ktorom je aktívny atóm kovu obkolesený 3D sieťou aminokyselín. Tejto sieti hovoríme odborne „sekundárna koordinačná sféra“, pretože ide o druhú vrstvu materiálu, obkolesujúcu katalyzátor. Tvorená je sieťou aminokyselinových zvyškov, ktoré majú vplyv na reaktivitu umelého enzýmu.

Ak sa v tejto sfére nachádza veľká aminokyselina, zmenší sa tým voľný priestor okolo katalyzátora a veľký substrát sa doň už nezmestí.

Podobný princíp platí aj pri menších aminokyselinách (uvoľnia miesto na vstup väčších látok), alebo pri rôznych nábojoch týchto zvyškov.

Kombináciou bielkoviny streptavidínu a katalyzátora s obsahom kovu pripravíme takzvaný umelý metaloenzým. Tento hybridný katalyzátor sa dá použiť vo vode, čím výrazne znižuje vplyv procesu na životné prostredie. Foto – Martina Ribar Hestericová

Zmena v štruktúre, zmena v reaktivite

3D sieť okolo katalyzátora zabezpečuje, že substrát môže pristúpiť ku katalyzátoru iba z jednej strany. Takto vzniká takzvaná enantioselektivita (umelý enzým počas reakcie produkuje viac jedného enantioméru produktu).

Enantioméry sú chirálne látky, ktoré sú chemicky totožné, navzájom však tvoria vlastné zrkadlové obrazy. Keď nimi prechádza polarizované svetlo, otočia jeho rovinu doľava alebo doprava. Podľa toho sa rozlišujú na ľavo- a pravotočivé.

Biologické vlastnosti však majú rôzne, pretože môžu rôzne interagovať s receptormi a enzýmami. Jeden z enantiomérov limonénu napríklad vonia ako pomaranč, kým druhý ako citrón a ihličnany, a to aj napriek tomu, že sú chemicky totožné.

Zmenami v štruktúre bielkoviny teda dokážeme robiť doslova divy v reaktivite výsledného umelého enzýmu, a to aj bez toho, aby sme akokoľvek museli meniť katalyzátor. Aby sa to však dalo robiť vo veľkom, potrebujeme robustnú metódu na prípravu veľa mutácií v bielkovine naraz, a práve o tom bol môj projekt.

Pojmy:

Umelé metaloenzýmy sú enzýmy, ktoré pripravujeme z bielkoviny a chemického katalyzátora obsahujúceho atóm kovu. Aby sme sa uistili, že katalyzátor zostane vnútri bielkoviny, využívame na ich prípravu veľmi silnú interakciu medzi streptavidínom (bielkovina) a vitamínom H (biotín).

Katalyzátor predstavuje chemickú zlúčeninu, ktorá urýchľuje priebeh chemickej reakcie. Po chemickej reakcii zostane katalyzátor nezmenený.

Molekulárna evolúcia je proces, počas ktorého sa v molekule (DNA alebo v bielkovine) z generácie na generáciu uskutočnia štrukturálne zmeny. Zmena v génoch vyvolá zmeny v štruktúre bielkoviny. Zmeny v bielkovine sa následne prejavia zmenami jej funkcie. Pri pohľade na celý organizmus vyvolávajú tieto zmeny DNA a bielkovín zmeny na bunkovej úrovni, no často aj na úrovni celého organizmu. Keďže naše umelé metaloenzýmy obsahujú bielkovinovú zložku, môžeme na nich uplatniť procesy typické pre evolúciu bielkovín.

Rýchlejšie, lepšie a efektívnejšie

Streptavidín pripravujeme pomocou baktérií Escherichia coli. Sú upravené tak, aby dokázali vo veľkom tvoriť nielen bielkoviny potrebné na ich prežitie a rast, ale aj náš streptavidín.

Každá jedna mutácia sa však musí pripraviť samostatne: na každý typ bielkoviny, ktorú chceme testovať, musíme pripraviť bakteriálnu kultúru, baktérie po určitom časte odseparovať, rozložiť a z výslednej zmesi vybrať našu bielkovinu.

Celý tento proces je veľmi zdĺhavý, príprava jediného druhu bielkoviny trvá aj niekoľko týždňov, pričom jej vlastnosti nemusia byť vôbec použiteľné. To bola motivácia pre môj projekt, s kolegami sme sa pokúšali vymyslieť systém, v ktorom by sme nemuseli našu mutantnú bielkovinu čistiť predtým, ako sme ju použili v chemických reakciách. Napokon sme objavili systém, ktorý nám umožnil pripraviť v malých množstvách stovky rôznych bielkovín naraz.

Namiesto litrov bakteriálnych kultúr používame maličké množstvá baktérií rastúcich v piatich mililitroch roztoku. Namiesto čistenia streptavidínu používame na katalýzu upravené mŕtve baktérie, do ktorých jednoducho pridáme náš katalyzátor a neskôr substrát.

Môj typický experiment si vyžaduje stabilné ruky, veľa pozornosti a ešte viac pipetovania. Každá chemická reakcia má objem iba pätinu mililitra, čím šetríme náklady aj materiál. Zdroj – Martina Ribar Hestericová

Na ceste za umelou bunkou

Tento proces výrazne znižuje čas a materiál potrebné na výskum z týždňov na iba niekoľko dní.

Keď som našu metódu otestovala, dokázala som už počas prípravy štyroch generácií nových enzýmov pripraviť dva výrazne lepšie mutanty: okrem vysokej reaktivity si dokážu zachovať aktivitu aj za prítomnosti rôznych organických rozpúšťadiel a za zvýšenej teploty.

Navyše, dokážu vysoko selektívne pripraviť cyklické amíny, dôležité zlúčeniny pre farmaceutický priemysel.

Použitie enzýmov v priemysle je čoraz populárnejšie, napríklad aj preto, že ich možno použiť vo vodnom prostredí. Tieto veľmi mierne reakčné podmienky zabezpečujú ochranu životného prostredia, ale aj zníženie nákladov na často veľmi drahé katalyzátory.

Okrem toho má náš výskum aj pomerne futuristickú stránku. Umelé enzýmy predstavujú jeden z komponentov potrebných na prípravu umelej bunky. Od tohto cieľa sme stále veľmi ďaleko, no každý pokrok aj v našom základnom výskume nás k nemu posúva čoraz bližšie.

Dostupné z doi: 10.1002/anie.201711016, 10.1038/nprot.2016.019, 10.1039/C6CC04604E

Príroda

Technológie

Veda

Teraz najčítanejšie