Ako funguje: zdrojový kód BioNTech/Pfizer vakcíny SARS-CoV-2

Pozrime sa naozaj zblízka na zdrojový kód vakcíny BioNTech/Pfizer SARS-CoV-2, aby sme zistili ako funguje.

Tento článok je prekladom článku Berta Huberta uverejnenom na jeho osobnom blogu.

E. Walzel

Chcem sa poďakovať veľkej skupine ľudí, ktorí si prečítali tento článok pred jeho publikáciou kvôli čitateľnosti a správnosti. Všetky chyby sú však moje, a rád by som o nich počul čo najskôr na [email protected] alebo @PowerDNS_Bert.

Vitajte! V tomto článku sa pozrieme znak po znaku na zdrojový kód BioNTech/Pfizer mRNA vakcíny SARS-CoV-2.

Tieto slová môžu znieť prekvapivo – vakcína je tekutina, ktorá sa injekciou pichá do ruky. Ako sa teda môžeme baviť o zdrojovom kóde?

Je to dobrá otázka. Začnime preto malou časťou BioNTech/Pfizer vakcíny BNT162b2, tiež známej ako Tozinameran tiež známej ako Comirnaty.

Prvých 500 znakov mRNA BNT162b2. Zdroj: World Health Organization

mRNA vakcína BNT162b má vo svojom srdci tento digitálny kód. Má 4284 znakov, takže by sa zmestil do zopár tweetov. Na začiatku výroby vakcíny niekto nahral tento kód do DNA tlačiarne (naozaj), ktorá potom premenila bajty z disku na molekuly DNA.

Z takéhoto zariadenia vychádza v malých množstvách DNA, ktorá sa po biologickom a chemickom spracovaní zmení na RNA (o tom trocha neskôr) v ampulke vakcíny. 30-mikrogramová dávka obsahuje práve tridsať mikrogramov RNA. Okrem toho sa tu nachádza aj premyslený lipidový (tukový) baliaci systém, ktorý dostane mRNA do našich buniek.

RNA je prechodná, „pracovná“ verzia DNA. DNA je ako flash pamäť v biologickom svete. DNA je trvácna, vnútorne redundantná a veľmi spoľahlivá. Ale podobne ako počítače nespúšťajú zdrojový kód priamo z disku, predtým, než sa niečo udeje, kód sa musí skopírovať na rýchlejší, všestrannejší a zároveň krehkejší systém.

Pre počítače je týmto systémom RAM, pre biológiu je to RNA. Tieto systémy sú si až prekvapujúco podobné. Narozdiel od flash disku, RAM degraduje omnoho rýchlejšie, pokiaľ sa o ňu nestaráme. Dôvod, prečo musí byť Pfizer/BioNTech mRNA vakcína uložená v najmrazivejších mrazničkách je podobný: RNA je krehká.

Každý znak RNA váži rádovo 0.53·10^-21 gramov, čo znamená, že v každej tridsaťmikrogramovej dávke vakcíny sa nachádza 6·10¹⁶ znakov. Vyjadrené v bajtoch, je to asi 25 petabajtov, aj keď je treba povedať, že tieto pozostávajú z asi 2000 miliárd opakovaní tých istých 4284 znakov. Skutočný informačný obsah je o čosi viac než jeden kilobajt. Samotný SARS-CoV-2 má asi 7,5 kilobajtov.

Naozaj krátky úvod

DNA je digitálny kód. Narozdiel od počítačov, ktore používajú 0 a 1, život používa A, C, G a U/T (známe ako „nukleotidy“, alebo „bázy“).

V počítačoch ukladáme 0 a 1 ako prítomnosť alebo neprítomnosť elektrického náboja, ako prúd, magnetickými prechodmi, ako napätie, ako moduláciu signálu, alebo ako zmenu v odrazivosti. Skrátka, nuly a jednotky nie sú akýmsi abstraktným konceptom, ale existujú ako elektróny, či iné fyzické objekty.

V prírode sú A, C, G a U/T molekulami, ktoré sú uložené ako reťazce v DNA (alebo RNA).

V počítačoch 8 bitov spájame do bajtu a bajt je typickou jednotkou dát, s ktorými potom pracujeme.

V prírode sa 3 nukleotidy spájajú do kodónu a kodón je typickou dátovou jednotkou. Jeden kodón obsahuje 6 bitov informácií (2 bity na každý znak DNA, 3 znaky = 6 bitov. To znamená 2⁶ = 64 rôznych hodnôt).

Zatiaľ celkom digitálne. Ak máte pochybnosti pozrite si digitálny kód priamo v dokumente od WHO.

Ďalší materiál k tejto téme sa nachádza aj tu – tento článok („What is life“) vám môže pomôcť lepšie pochopiť zvyšok tohto článku.
Prípadne ak máte radi video, mám tu pre vás dve hodiny.

Takže čo vlastne ten kód robí?!

Základná myšlienka vakcíny je naučiť náš imunitný systém bojovať s patogénom bez toho, aby sme sa ním nakazili. V minulosti sa za týmto účelom vpichol oslabený alebo utlmený (atenuovaný) vírus spolu s „adjuvans“, ktoré pomáhajú vystrašiť a tým naštartovať imunitný systém. Toto bola rozhodne analógová technika, ktorá si vyžadovala prípravu miliárd vajíčok (alebo hmyzu). Tiež bola náročná na šťastie a čas. Niekedy sa dokonca musel využiť iný (nesúvisiaci) vírus.

mRNA vakcína dokáže dosiahnuť rovnaký cieľ („vytrénovať náš imunitný systém“), no „laserovým“ spôsobom. A to myslím v oboch zmysloch slova: veľmi precízne a s veľkou silou.

Funguje to takto. Injekcia obsahuje nestály genetický materiál, ktorý opisuje slávny SARS-CoV-2 ‚Spike‘ proteín. Pomocou dômyselných chemických protriedkov dokáže vakcína dopraviť tento gentický materiál do niektorých našich buniek.

Tieto bunky začnú pracovito vyrábať SARS-CoV-2 Spike proteíny v množstvách dosť veľkých na to, aby naštartovali náš imunitný systém do akcie. Keď náš imunitný systém narazí na Spike proteíny a (hlavne) na signály, že niektoré bunky boli napadnuté, vyvinie ráznu obrannú reakciu voči niekoľkým aspektom Spike proteínov A aj ich výrobnému procesu.

A toto je to, vďaka čomu máme vakcínu s 95% účinnosťou.

Zdrojový kód!

Začnime úplne od začiatku, napríklad tu. Dokument od WHO obsahuje tento užitočný obrázok:

Vidíme niečo ako obsah. Začneme „čiapkou“ („cap“) ktorá je znázornená ako malá šiltovka.

Tak, ako sú dôležité opcodes v počítačových súboroch, aj biologický operačný systém potrebuje hlavičky, má linkery a veci ako volacie konvencie.

Kód vakcíny začína týmito dvoma nukleotidmi:

GA

Toto sa dá veľmi dobre prirovnať ku každému spustiteľnému DOS a Windows súboru, ktorý začína na MZ, alebo k UNIX skriptom, ktoré začínajú na #!. V biológií ani v operačných systémoch sa tieto dva znaky nijak nespúšťajú. No je ich treba, lebo bez nich by sa nič nezačalo diať.

mRNA „čiapka“ má mnoho funkcií. Napríklad označuje, že kód pochádza z bunkového jadra. V našom prípade tomu tak samozrejme nie je, náš kód pochádza z vakcíny. Ale toto bunke nepovieme. Čiapka napomáha nášmu kódu vyzerať bezpečne a tým ho chráni pred predčasným zničením.

Prvé dva GA nukleotidy sú tiež chemicky mierne odlišné od zvyšku RNA. Dá sa povedať, že GA nesie mimopásmový (out-of-band) signál.

„5′ neprekladaná oblasť“

Trocha žargónu. Molekuly RNA sa dajú čítať len v jednom smere. Časť, kde sa čítanie začína sa nazýva 5′ alebo „five-prime“. Čítanie sa končí na konci 3′ alebo three-prime.

Život sa skladá z proteínov (alebo z vecí vyrobených z proteínov). A tieto proteíny sú opísané v RNA. Keď sa RNA premieňa na proteíny, hovoríme tomu preklad, alebo translácia.

Tu máme 5′ neprekladanú oblasť („untranslated region“ – „UTR“), teda časť kódu, ktorá sa nebude nachádzať v proteíne.

GAAΨAAACΨAGΨAΨΨCΨΨCΨGGΨCCCCACAGACΨCAGAGAGAACCCGCCACC

A tu je prvé prekvapenie. Bežné znaky RNA sú A, C, G a U. U je tiež známe ako „T“ v DNA. Ale tu máme Ψ, čo sa deje?

Toto je jedna z viacerých výnimočne dômyselných častí tejto vakcíny. V našom tele beží veľmi účinný antivírusový systém („prvý antivír“). Z tohto dôvodu sú bunky veľmi neochotné prijať cudziu RNA a snažia ju čím skôr zničiť, než niečo spôsobí.

Toto je pre našu vakcínu trocha problematické – musí sa dostať cez náš imunitný systém. Po mnohých rokoch experimentov sa zistilo, že keď sa U v RNA vymení za mierne modifikovanú molekulu, náš imunitný systém o ňu stratí záujem. Úplne vážne.

Takže vo vakcíne BioNTech/Pfizer sa každé U vymenilo za 1-metyl-3′-pseudouridylyl, označovaný Ψ. Genialita tejto zámeny je v tom, že aj keď Ψ upokojí náš imunitný systém, vo všetkých dôležitých častiach bunky je prijaté ako normálne U.

V počítačovej bezpečnosti tiež poznáme tento trik – niekedy je možné poslať mierne upravenú verziu správy ktorá zmätie firewally a bezpečnostné riešenia, no je stále spracovaná backend servermi – a vtedy sme hacknutí.

Dnes využívame výsledky základného výskumu z minulosti. Objavitelia
techniky s Ψ museli bojovať o to, aby na ich prácu mali dostatok prostriedkov a aby jej výsledky boli prijaté. Všetci by
sme mali byť za túto prácu vďační a som si istý, že prídu aj Nobelove ceny.

Mnoho ľudí sa pýta, či by aj vírusy mohli použiť Ψ na to, aby obišli naše imunitné systémy. V skratke, toto je nanajvýš nepravdepodobné. Život jednoducho nemá mechanizmy na to, aby vyrobil nukleotidy 1-metyl-3′-pseudouridylylu. Vírusy sa pri svojej reprodukcii spoliehajú na štandardné biologické mechanizmy, ktoré túto schopnosť jednoducho nemajú. mRNA vakcíny v ľudskom tele zanikajú veľmi rýchlo a neexistuje možnosť, aby sa RNA s Ψ rozmnožovala naďalej. Dobré čítanie k téme: „No, Really, mRNA Vaccines Are Not Going To Affect Your DNA“.

OK, späť k 5′ UTR. Čo týchto 51 znakov vlastne robí. Ako to už v prírode chodí, takmer nič nemá len jednu konkrétnu fukciu.

Keď naše bunky potrebujú preložiť RNA na proteíny, tento proces prebieha v „prístroji“, zvanom ribozóm. Ribozóm je niečo ako 3D tlačiareň na proteíny. Spracúva vlákno RNA a podľa neho vyrába reťazec aminokyselín, ktoré sa potom zložia do proteínu.

Zdroj: Wikipedia, používateľ Bensaccount

Toto vidíme hore. Čierna páska na spodku je RNA. Páska, ktorá sa objaví v zelenej časti je proteín, ktorý sa vytvára. Veci, ktoré prilietajú a odlietajú sú aminokyseliny a „adaptéry“, vďaka ktorým pasujú do RNA.

Aby fungoval musí tento ribozóm musí fyzicky sedieť na vlákne RNA. Po tom, čo sa usadí, môže vytvárať proteíny podľa RNA ktorú práve spracúva. Z tohto sa môžeme dovtípiť, že časti na ktoré si sadne ako prvé, nemôže spracovať hneď. Toto je len jedna z funkcií UTR: pristávacia plocha pre ribozóm. UTR poskytuje navádzanie.

UTR tiež poskytuje metadáta: kedy má translácia začať? Koľko jej má byť? Pre vakcínu použili „najokamžitejšiu“ UTR akú našli, prevzatú z génu alfaglobínu. Tento gén je známy tým, že spoľahlivo vyrába veľké množstvo proteínu. Vedcom sa v minulosti podarilo túto UTR ešte ďalej zoptimalizovať (podľa dokumentu od WHO), takže toto nie je celkom UTR pre alfaglobín. Je to ešte lepšie.

S-glykoproteínový signálny peptid

Ako bolo spomenuté, cieľom vakcíny je prinútiť bunku, aby začala vyrábať veľké množstvá Spike proteínu vírusu SARS-CoV-2. Doteraz sme sa stretli prevažne s metadátami a „volacími konvenciami“ v zdrojovom kóde vakcíny. No teraz sa dostávame do samotného teritória vírusového proteínu.

Najprv sa však musíme dostať cez ďalšiu vrstvu metadát. Potom, čo ribozóm (z vynikajúcej animácie hore) vytvorí proteín, tento proteín musí ešte niekam ísť. Toto je zakódované v „S-glykoproteínovom signálovom peptide (rozšírenej vedúcej sekvencii)“

Dá sa tomu chápať, že na začiatku proteínu je akýsi štítok s adresou, ktorý je zakódovaný v proteíne. V tomto konkrétnom prípade signálny peptid vraví, že proteín by mal z bunky vyjsť cez „endoplazmatické retikulum“. Takéto parádne výrazy nie sú ani v Star Treku!

„Signálny peptid“ nie je veľmi dlhý, no keď sa pozrieme kód, nájdeme medzi vírusom a RNA vakcíny rozdiely:

(Pre jednoduchšie porovnanie som vymenil zmenené Ψ za bežné RNA U)

Takže, čo sa tu deje? Nespojil som RNA do trojíc len tak náhodou. Tri znaky RNA tvoria kodón. A každý kodón kóduje špecifickú aminokyselinu. Signálny peptid vo vakcíne pozostáva z presne tých istých aminokyselín ako samotný vírus.

Ako je potom možné že RNA je iná?

Existuje 4³=64 rôznych kodónov, kedže existujú 4 rôzne RNA znaky a v kódone sú po troch. Máme však len 20 rôznych aminokyselín. To znamená že niekoľko rôzných kodónov kóduje tú istú aminokyselinu.

Život používa túto takmer univerzálnu tabuľku na mapovanie kodónov RNA na aminokyseliny.

V tejto tabuľke vidíme, že modifikácie vo vakcíne (UUU -> UUC) sú všetky synonymické. RNA kód vakcíny je iný, no vzniknú z neho rovnaké aminokyseliny a proteíny.

Keď sa pozrieme bližšie, všimneme si, že väčšina zmien sa deje v tretej pozicií v kodóne, označené „3“ nad kodónom. A keď sa pozrieme do univerzálnej tabuľky kodónov, uvidíme, že pre produkciu aminokyselín tretia pozícia v kodóne nebýva rozhodujúca.

Takže tieto zmeny sú synonymické, ale načo tam potom sú? Keď sa pozrieme bližšie, zistíme, že všetky zmeny okrem jedinej zvyšujú počet C a G.

Načo je to dobré? Ako sa spomína vyššie, náš imunitný systém nemá v obľube „exogénnu“ RNA, teda RNA nepochádzajúcu z bunky. Aby sa predišlo takejto detekcii, už sme zamenili U v RNA za Ψ.

Ukázalo sa však, že RNA s výšším počtom G a C sa tiež efektívnejšie premieňa na proteíny.

A toto sa podarilo dosiahnuť zámenou čo najväčšieho počtu znakov za G alebo C.

Celkom ma fascinuje, že jedna zmena neviedla k zvýšeniu počtu C alebo G,
modifikácia CCA -> CCU. Ak niekto pozná dôvod prečo, dajte mi prosím vedieť!
Rozumiem tomu, že niektoré kodóny sa v ľudskom tele objavujú častejšie, než
iné, ale tiež som čítal, že toto nevedie k veľkej zmene v rýchlosti prekladu.

Samotný Spike proteín

Ďalších 3777 znakov RNA vakcíny obsahuje podobné „kodónové optimalizácie“ na pridanie C a G. Kvôli lepšej čitateľnosti ich sem neuvediem všetky, ale rád by som sa zameral na jednu obzvlášť špeciálnu časť. Toto je časť, vďaka ktorej to celé funguje; časť, ktorá nám pomôže vrátiť sa do normálnych koľají.

Vidíme tu známe synonymické zmeny v RNA. Napríklad, v prvom kodóne vidíme, že CUU sa mení na CUG. Toto pridáva do vakcíny ďalšie „G“ a my vieme, že toto pomáha zlepšiť produkciu proteínov. CUU aj CUG oba kódujú aminokyselinu „L“, alebo leucín, takže v proteíne sa touto zmenou nič nemení.

Keď porovnáme celý Spike proteín vo vakcíne, všetky zmeny sú podobne synonymické… okrem dvoch, na ktoré sa teraz pozeráme.

Tretí a štvrtý kodón vyššie predstavujú skutočné zmeny. Amynokyseliny K a V sú obe vymenené za „P“, prolín. Kvôli tejto zmene boli potrebné tri zmeny („!!!„) pre „K“ a dve zmeny („!!„) pre „V“.

A tieto dve zmeny vystrelia účinnosť vakcíny do nových výšok.

Ako je to možné? Ak sa pozriete na skutočnú časticu SARS-CoV-2, uvidíte Spike proteíny ako skupinu výčnelkov:

Výčnelky sú pripevnené k telu vírusu (k „nukleokapsidovému proteínu“). Ale pozor, naša vakcína vyrába iba výčnelky a tie nepripevňujeme k žiadnemu telu vírusu.

Vo svojej nezmenenej forme sa samostatné Spike proteíny poskladajú do inej štruktúry. Ak by sme dostali takúto vakcínu, naše telo by si vybudovalo imunitu. Avšak, bola by to imunita voči iným, „poskladaným“ spike proteínom.

A potom sa ukáže naozajstný SARS-CoV-2 s neposkladanými, pichľavými Spike proteínmi. Vakcína by v tomto prípade nebola príliš účinná.

Čo s tým? V roku 2017 vedci popísali, ako dve zámeny za prolín na správnych miestach dokážu SARS-CoV-1 a MERS S proteíny udržať v ich „neposkladanej“ konfigurácii aj bez toho, aby boli súčasťou celého vírusu. Funguje to vďaka tomu, že prolín je veľmi stabilnou aminokyselinou. Slúži ako dlaha, vďaka ktorej môžeme proteín zastabilizovať v stave, v ktorom ho potrebujeme ukázať imunitnému systému.

Ľudia, ktorí prišli na tento trik by si mali teraz neustále dávať high-fives a vyžarovať nafúkanosť. A bolo by to úplne v poriadku.

Novinka! Kontaktovali ma ľudia z tímu McLellan Lab, jednej zo skupín, ktorá stojí za týmto prolínovým objavom. Dozvedel som sa, že high-fives sú nateraz pozastavené kvôli pandemickej situácií, no sú radi, že mohli prispieť k vývoju vakcín. Tiež chceli upozorniť na dôležitosť práce mnohých iných skupín, pracovníkov a dobrovoľníkov.

Koniec proteínu, ďalšie kroky

Ak sa preskrolujeme cez zvyšok zdrojového kódu, môžeme si všimnúť drobných zmien na konci Spike proteínu:

Na konci proteínu nájdeme „stop“ kodón, označený malým „s“. Toto je spôsob ako slušne povedať, že proteín by mal končiť tu. Vírus používa
stop kodón UAA, vakcína zas, zrejme pre istotu, dva stop kodóny UGA.

3′ neprekladaná oblasť

Podobne, ako keď ribozóm potreboval „naviesť“ na 5′-konci, kde sme našli „5′ neprekladanú oblasť“, takisto na konci oblasti kódujúcej proteín nájdeme podobnú štruktúru, ktorú nazývame 3′ UTR („three prime untranslated region“).

O 3′ UTR sa dá napísať mnoho, no ja si pomôžem citátom z Wikipedie: „3′ neprekladaná oblasť je dôležitá pre génovú expresiu kvôli jej vplyvu na účinnosť lokalizácie, stability, exportu a translácie mRNA … napriek ich nášmu súčasnému porozumeniu, 3′ UTR sú pre nás stále relatívnou záhadou.„.

Čo vieme určite je, že niektoré 3′ UTR sú veľmi úspešné pri napomáhaní tvorby proteínov. Podľa dokumentu od WHO, bola 3′ UTR vo BioNTech/Pfizer vakcíne vybraná z „mRNA amino-terminal enhancer of split (AES) a mitochondriálnej kódovanej 12S ribozómovej RNA na dosiahnutie stability RNA a vysokej expresie proteínu.“ K čomu len dodám: dobrá práca.

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA je koniec

Úplny koniec mRNA je polyadenylovaný. Čo je komplikovaný spôsob, ako povedať, že končí kopou AAAAAAAAAAAAAAAAAAA. Zdá sa, že ešte aj mRNA už mala roku 2020 dosť.

mRNA môže byť použitá viackrát, no pri každom použití stratí niekoľko A-čok na konci. Keď sa A-čka minú, mRNA prestáva byť funkčná a zahodí sa. V tomto zmysle slúži „poly-A“ koniec ako ochrana pred degradáciou.

Niekoľko štúdií sa venovalo tomu, aký je optimálny počet A-čok na konci mRNA vakcín. Vo voľne prístupnej literatúre som sa dozvedel, že toto číslo môže byť až 120.

Vakcína BNT162b2 končí na:

Teda 30 A-čok, potom prepájací „linker“ s desiatimi nukleotidmi (GCAUAUGACU) a napokon ďalších 70 A-čok.

Predpokladám, že toto je výsledok ďalších optimalizácií na zvýšenie proteinovej expresie.

Záverom

Poznáme teda presné zloženie mRNA vakcíny BNT162b2 a pri väčšine jej súčastí aj rozumieme, na čo slúžia:

čiapka, ktorá sa stará o to, aby RNA vyzerala ako bežná mRNA
dobre známa a zoptimalizovaná 5′ neprekladaná oblasť (UTR)
signálny peptid s optimalizovanými kodónmi, ktorý odošle Spike proteín na správne miesto (presne skoprírovaný z pôvodného vírusu)
verzia originálneho výčnelku s optimalizovanými kodónmi a s dvoma zámenami za „prolín“, ktoré zaručia že proteín ostane v správnom tvare
dobre známa a zoptimalizovaná 3′ neprekladaná oblasť
trocha záhadný poly-A koniec s nevysvetleným prepajacím „linkerom“

Kodónové optimalizácie pridávajú do mRNA kopu G-čok a C-čok. Použitie Ψ (1-metyl-3′-pseudouridylylu) namiesto U zasa pomáha vyhnúť sa imunitnému systému, takže mRNA vydrží dostatočne dlho na to, aby nám ho pomohla vytrénovať.