Keby každá bunka mohla rozprávať

Marek, tento mesiac ti vyšiel článok v Nature Biotechnology, na ktorom si prvým a korešpondenčným autorom. Ako by si stručne popísal, o čom je?

V článku popisujeme novú metódu, ktorá umožňuje zisťovať, ako sa rôzne verzie histónov viažu na genóm v tisíckach jednotlivých buniek naraz. Históny sú malé proteíny, ktoré sa viažu k DNA, a tak prinášajú tzv. epigenetickú informáciu napríklad o tom, či sa má určitý gén “zapnúť” alebo “vypnúť”.

Čo to je epigenetika?

Epigenetika znamená, že sa pozeráme na informáciu, ktorá je síce uložená v DNA, ale nie na úrovni poradia písmeniek (nukleotidov) v DNA, ale je tam dodatočne vložená rôznymi modifikáciami. To znamená, že len prečítaním sekvencie písmeniek (sekvenovaním) sa skoro nič o epigenetickej informácii nedozvieme. Na to potrebujeme iné metódy.

Načo ale potrebujeme prečítať aj epigenetickú informáciu? Ako sa táto informácia líši od tej, ktorá v zdedenej DNA už je? A čo všetko takáto epigenetická informácia ovplyvňuje?

Epigenetická informácia je odlišná od genetickej v tom, že je veľmi flexibilná. DNA sekvencia, čiže genetická informácia, je u každého človeka určená veľmi skoro po počatí na úrovni embrya, zatiaľ čo epigenetická informácia sa počas života veľmi výrazne mení. Napríklad epigenetický profil u novorodenca bude iný ako profil dieťaťa alebo dospelého človeka.

Navyše aj vonkajšie vplyvy prostredia ovplyvňujú epigenetickú informáciu. Identické dvojičky, ktoré majú presne rovnakú genetickú informáciu, nebudú vyzerať ani správať sa rovnako. Majú medzi sebou rozdiely v epigenetike.

A doteraz neexistovali metódy, ktoré by umožňovali prečítať epigenetickú informáciu?

Na prečítanie jedného typu epigenetickej informácie, tzv. modifikácii histónov, sme doteraz nemali veľmi citlivé metódy. Moja nová metóda, ktorú som vymyslel a optimalizoval (single-cell CUT&Tag), teraz prináša možnosť pozerať sa na epigenetickú informáciu uloženú v histónoch z jednej jedinej bunky – napríklad v jednom neuróne alebo v jednej kožnej bunke. Toto bolo predtým extrémne náročné a takmer nikto na svete tieto merania nerobil. Moja nová metóda tento proces zjednodušila a umožňuje merať epigentickú informáciu desaťtisícov až stotisícov buniek naraz, ale s rozlíšením jedinej bunky.

Prečo je dôležité vedieť takéto merania urobiť len v jednotlivej bunke?

Toto je veľmi dôležité hlavne, ak sa pozeráme na komplikované tkanivá, akým je napríklad mozog. Mozog sa skladá z veľkého množstva bunkových typov, napríklad neuróny (ktorých existuje niekoľko desiatok druhov), astrocyty, oligodendrocyty alebo mikroglia, a navyše v rámci týchto druhov môžu byť bunky epigeneticky rozdielne.

Kvôli čomu je tento článok a výskum v ňom publikovaný taký významný? Kde je jeho najsilnejšie miesto a prečo jeho publikovanie vyvolalo rozsiahlu reakciu na rôznych sociálnych sieťach a v zahraničných vedecko-popularizačných časopisoch?

Článok mal naozaj dosť veľký ohlas na twitteri aj v vedecko-popularizačných médiách a dostali sme množstvo pozitívnych reakcií. Myslím, že ľudia sú hlavne nadšení z toho, že táto metóda má potenciál byť ľahko prenosná aj do iných laboratórií. Na rozdiel od predchádzajúcich metód, ktoré umožnili rovnaké merania, sa dá celá urobiť na komerčne dostupných zariadeniach. Takže ktokoľvek, kto si kúpi existujúcu mašinku, si môže sám metódu v laboratóriu urobiť.

Takisto sme dostali ohlasy hovoriace, že naše dáta, ktoré sme poskytli ako potvrdenie fungujúcej koncepcie (proof of concept), sú vysoko kvalitné a budú slúžiť ako nový štandard pre tento typ dát v nasledujúcich rokoch.

Čo všetko sa dá zistiť touto metódou? 

Momentálne to je skôr metóda, ktorá bude extrémne užitočná pre základný výskum. Pravdou je, že s rozlíšením jednej bunky momentálne nevieme, akú epigenetickú komplexitu skrývajú tkanivá alebo orgány. V prvom rade teda musíme popísať túto informáciu v normálnom ľudskom organizme. Ale zároveň ju budeme používať na to, aby sme našli špecifické epigenetické zmeny, ktoré sú spojené s chorobami. Napríklad v našom laboratóriu sa venujeme štúdiu roztrúsenej sklerózy a aj na túto chorobu budeme v najbližšej dobe aplikovať moju metódu.

Je to možno diagnostická metóda budúcnosti? Čo sa o vplyve epigenetiky na bunky zatiaľ vie?

Určite si viem predstaviť, že by sa táto metóda dala aplikovať aj v klinike, napríklad pri analýze biopsií nádorových ochorení. Pomocou našej novej metódy by sme mohli získať lepší prehľad o epigenetickej rôznorodosti nádorového tkaniva a lepšie nadizajnovať liečbu. Na to by ale v prvom rade musela byť táto metóda lacnejšia. Už teraz ale rozmýšľame nad modifikáciami mojej metódy tak, aby mohla byť použitá na analýzu ľahšie dostupných biologických vzoriek, ako napríklad krv alebo mozgovomiechový mok.

Aké laboratórne techniky si pri svojej práci na článku využil a čo si sa musel najskôr naučiť?

Mojou hlavnou motiváciou, prečo som po PhD štúdiu v Brne prišiel na Karolínsky inštitút (KI) do Štokholmu, bolo, že som sa chcel naučiť viac o nervovej sústave. Začal som tu pracovať najprv na úlohách dlhých nekódujucich RNA vo vývoje CNS. A keďže nekódujuce RNA sú úzko spojené s epigenetikou, asi po dvoch rokoch som začal viac študovať aj epigenetiku. S tým sú spojené napríklad metódy spojené s architektúrou genómu, ako napríklad Hi-C alebo HiChIP, alebo CUT&Run a CUT&Tag. Takisto som sa naučil pracovať s tzv “single-cell” metódami (pozn. analýza z každej bunky samostatne), ako napríklad single-cell RNA-seq alebo singel-cell ATAC-seq. Všetko sú to metódy založené na DNA sekvenovaní, ktoré generujú veľké množstvo dát. Keďže si bioinformatické analýzý dát robím sám, tak som sa zlepšil aj v bioinformatike. Napríklad som sa minulý rok konečne naučil používať informatický nástroj git na kontrolu verzií kódu/softvéru.

Zároveň som sa tu naučil veľmi veľa o nervovom systéme. Nie je to len o metódach, ale o takej celkovej expozícií a know-how, čo všetko sa dá robiť s primárnymi vzorkami z tkanív. Teraz si napríklad viem zobrať kúsok mozgu z myši alebo z pacientskej vzorky a spracovať tkanivo tak, aby sa dalo použiť na moje experimenty. Tieto skúsenosti mi otvorili úplne nové obzory ako bežať experimenty, ktoré dávajú výsledky viac relevantné pre medicínu, ako len experimenty s bunkovými kultúrami alebo s modelovými organizmami.

Prečo sú takto tie experimenty viac relevantné pre medicínu?

Pretože pracujeme s viac relevantným biologickým materiálom. Je síce pekné, keď liečivo zabíja rakovinové bunky, ktoré rastú na miske v bunkovej kultúre. Ale v medicíne je potrebné vyvíjať liečivá, ktoré fungujú v reálnom tkanive a organizme.

Do článku si robil aj rôzne komplikované bioinformatické analýzy, to nie je niečo, čo sa človek naučí za mesiac kurzu na škole. Aký proces to bol v tvojom prípade?

Ja som sa začal učiť bioinformatike počas PhD v Brne. Mal som smolu, že moje výsledky z DNA sekvenovania nemal kto spracovať. DNA sekvenovanie bolo v tom čase vo svojich začiatkoch a nebolo veľa ľudí, čo by takéto dáta vedeli analyzovať. Zároveň som mal šťastie, že moja školiteľka Štepánka Vaňáčová mi umožnila vycestovať na stáž do Edinburghu do laboratória Grzegorza Kudlu, ktorý mal skúsenosti s týmito analýzami a súhlasil s tým, aby som sa ich prišiel k nemu naučiť. To mi dalo základ, a potom som sa už viac-menej učil a zlepšoval svojpomocne. Veľa programov a algoritmov na analýzy je vyvýjaných v špecializovaných laboratóriách, ale aby ich človek mohol používať, musí ovládať minimálne prácu v UNIX príkazovom riadku. Ja k tomu ešte ovládam programovací alebo štatistický jazyk R a python, v ktorom si píšem skripty. Tieto jazyky sa dajú naučiť na kurzoch, ale skúsenosti s prácou s reálnymi dátami sú nenahraditeľné.

V rámci svojej práce si využíval aj rôzne “Core Facility*” na Karolínskom inštitúte. O koľko ťažšie by bolo pracovať s podobnými technikami na ústavoch-inštitútoch, ktoré takúto infraštruktúru nemajú dostatočne vybudovanú?

Karolínska má naozaj úžasné core facility, ktoré človeku vedia uľahčiť život. Ja som napríklad použil službu, kde mi facilita zaklonovala a spurifikovala rekombinantný proteín. Nie je to nič, čo by som si nemohol urobiť sám, ale to, že som mohol túto rutinnú prácu outsourcovať, mi ušetrilo minimálne mesiac práce. Takisto som využil služby niekoľkých ďalších facilít, ako napríklad CRISPR facility, single-cell genomics facility, DNA sekvenačnej facility alebo facility, ktorá pre mňa vyprodukovala lentivírus. Hlavná výhoda týchto facilit je, že často majú k dispozícií špecializované zariadenia, takže ich už nemusíme nakupovať u nás v laboratóriu, čo by bolo veľmi neefektívne, ale môžeme sa sústrediť na iné experimenty. Napríklad v našom laboratóriu máme len jeden malý DNA sekvenátor a na všetky veľké projekty môžeme použiť služby v DNA sekvenačnej facilite, ktorá je špičkovo vybavená prístrojmi aj personálom.

*Core facility sú technologicky vyspelé laboratóriá, ktoré poskytujú svoje služby ako servis pre vedcov v rámci inštitútu, takže si nemusia kupovať sami drahé prístroje. 

Ako dlho ti trvala práca na projekte celkovo? Od prvého experimentu, cez analýzy až po prvotné zverejnenie článku v BioRxive (pozn. platforma na voľné zverejňovanie vedeckých prác pred recenzným konaním a publikovaním vo vedeckom časopise) a následne aj v NatureBiotech? Veľká časť práce na článku prebehla v čase celosvetovej pandémie. Aký dôsledok to na tvoj prácu malo?

Tento projekt bol z kategórie bleskových. Prvýkrát som môjmu šéfovi Goncalovi navrhol tento projekt asi v októbri 2019, metódu sme mali hotovú v januári 2020 a všetky dáta zozberané v júni. Preprint sme zavesili na BioRxiv a poslali do Nature Biotechu v septembri 2020, takže to trvalo cca 1 rok od vymyslenia projektu po odoslanie. Toto je na pomery v biológii extrémne bleskový projekt a asi takúto rýchlosť tak skoro netromfnem.

Pandémia moju prácu nejako extrémne nespomalila, ba možno dokonca môj projekt urýchlila, keďže som mohol asi 6 mesiacov sedieť len doma a sústrediť sa na analýzu dát a spisovanie článku. Príde mi, že v časoch pred pandémiou by som štandardne dochádzal každý deň do práce, ako bolo odo mňa očakávané. Som rád, že sa zbúral stereotyp, že práca z domu nie je tak efektívna, ako keď je človek fyzicky na pracovisku. Samozrejme, už sa teším, až budeme všetci zaočkovaní a budeme sa môcť zase normálne všetci stretávať a vybrať si, či chceme pracovať z domu alebo dochádzať na pracovisko.

Ako prebiehal recenzný proces? Koľko hodnotiteľov ste v článku mali? Koľko ďalších experimentov ste museli spraviť? 

Recenzie, ktoré sme dostali, boli veľmi pozitívne. Mali sme len dvoch recenzentov, čo bolo prekvapenie. Navrhli nám ďalšie experimenty a analýzy, ktoré by lepšie porovnali našu novú techniku s predošlými technológiami. Už dopredu sme si mysleli, že recenzenti budú mať práve takéto požiadavky, takže sme sa na to pripravili. Experimenty a analýzy, ktoré sme do článku pridali počas review procesu, ešte lepšie ukázali, že naša nová technika prináša veľa výhod v porovnaní s predchádzajúcimi. Po jednom kole recenzií boli recenzenti spokojní a článok mohol byť publikovaný.

Aké máš plány do budúcnosti? Budeš pokračovať ďalej na tomto projekte alebo sa začneš venovať iným nápadom?

Momentálne pracujem na ďalšej, vylepšenej verzii mojej techniky. Snažím sa vyvinúť, aby moja technika mohla byť použitá na meranie troch rôznych druhov epigenetickej informácie na úrovni jednej bunky. To by nám poskytlo ešte lepšie a hlbšie dáta a vedeli by sme lepšie pochopiť, ako epigenetická informácia ovplyvňuje funkciu bunky. Navyše, keďže článok publikovaný v Nature Biotechnology sa venoval CNS v myšiach, rád by som aplikoval moju metódu na ľudské vzorky, jednak počas vývoja a takisto na tkanivo z biobánk, ktoré pochádza od ľudských darcov s rôznymi ochoreniami, napríklad s roztrúsenou sklerózou (multiple sclerosis, MS).

Popri práci na svojich projektoch sa stíhaš aj venovať sa rôznym magisterským študentom. Koľko si ich za 4 roky na KI viedol? Ako si ich vyberáš? Čo sú hlavné charakteristiky, ktoré u svojich študentiek a študentov hľadáš? Ide o študentov z KI alebo prichádzajú z rôznych inštitútov po celej Európe?

Ja som sa venoval vedeniu študentov už počas môjho PhD v Brne, kde som bol mentor jednej magisterskej študentke, ktorá je teraz na PhD v Helsinkách, a mentor jednej PhD študentke, s ktorou som robil na spoločnom projekte. Tu v Štokholme som už oficiálny spolu-školiteľ jednému super talentovanému PhD študentovi a celkovo školím už štvrtého magisterského študenta. Študenti sú v podstate z celého sveta. Ja z nejakého dôvodu priťahujem študentov a študentky z Nemecka, traja zo štyroch magistrov pochádzali odtiaľ. Čo je zaujímavé, tak ešte ani jeden študent, ktorého som školil, nebol z Karolinskej. Mal som študenta zo Stockholm University, z Uppsaly, Heidelbergu a teraz z Maastrichtu. Takúto mobilitu študentov a študentiek považujem za veľmi dôležitú a myslím, že to, že študenti si môžu vybrať univerzitu a laboratórium, kde robia svoje projekty, im otvára nové možnosti a dáva im možnosť nadobudnúť nenahraditeľné skúsenosti.

V labe, v ktorom pracujem, máme šťastie, že študentov si môžeme priamo vyberať my sami. Pre mňa sú najdôležitejšie kritériá samozrejme predošlé skúsenosti a znalosti, ale takisto sa snažím posúdiť sám, aký je študent proaktívny a kreatívny. Napríklad momentálne školím študentku, ktorá na bakalárskom programe študovala psychológiu, čo je absolútne mimo toho, čo robíme my, ale na pohovore ukázala na svoje znalosti veľkú kreativitu a priamo mi navrhla nový projekt, na ktorom by chcela robiť.

Čo by bola tvoja rada pre mladých ľudí, ktorí sú len na začiatku svojej budúcej vedeckej kariéry, podľa čoho si majú vybrať, čomu sa venovať, na čo sa sústrediť?

Ak mám dať radu podľa seba, tak si myslím, že najdôležitejšie je, aby ich bavilo to, čo robia. Ja som sa riadil pravidlom, že chcem robiť prácu, ktorá ma bude baviť, ktorá bude cool a zaujímavá a zároveň sa pri nej budem učiť novým veciam. Preto som šiel na PhD do Brna – chcel som sa naučiť niečo nové o svete RNA a takisto aj do Štokholmu, kde som sa chcel naučiť viac o nervovej sústave. Zároveň si myslím, že sa netreba brať nejako strašne vážne. Hlavne ide o to, aby sa človek bavil tým, čo robí a netreba byť nejako upnutý na výsledky, články, granty alebo dáke ocenenia. Kariéra vo vede je nevyspytateľná a vyžaduje si, aby človek publikoval v top časopisoch, čo je nielen o schopnostiach ale aj napr. o šťastí alebo o dobrých kontaktoch, a nie vždy sa to musí podariť.

Samozrejme, treba aj usilovne pracovať, ale to sa nedá non-stop, a preto je dôležité si aj uvedomiť, kedy treba pridať a kedy sa dá naopak trochu ubrať. Napríklad pre mňa bol posledný rok pracovne veľmi náročný, pretože som cítil, že mám šancu na výbornú publikáciu, a tak som na tom pracoval o to intenzívnejšie.

A ešte jedna rada pre študentov – je dobré mať čo najviac skúseností s rôznymi profesormi, laboratóriami, miestami a krajinami. V každej krajine, kde som ja pôsobil, sa veda robí trochu inak, a na každom mieste sa človek môže naučiť niečo o tom, ako sa to má alebo nemá robiť a niečo si z toho zobrať pre seba.

Kde najbližšie budeš rozprávať o svojom výskume? Máš pozvánku na prednášku aj na Slovensku?

Áno, v stredu 5.5. budem mať popularizačnú prednášku na online evente Večer zvedavých (Nerd Nite), takže ak chcete vedieť viac na tému epigenetiky, určite sa prídite pozrieť. Event je myslim na facebooku Večera zvedavých, kde sú aj všetky detaily k tomu, ako sa k nemu dá pripojiť. Okrem toho ma môžete často stretnúť na epigeneticky alebo RNA zameraných konferenciách.

Marek Bartošovič

Vyštudoval biochémiu na Prírodovedeckej Fakulte Univerzity Komenského v Bratislave. Potom pokračoval v PhD štúdiu na Masarykovej Univerzite v Brne, kde sa venoval štúdiu RNA modifikácií a RNA metabolizmu. Počas PhD štúdia sa začal okrem molekulárnej biológie venovať aj bioinformatike.

Od roku 2017 pôsobí ako postdok na Karolínskom Inštitúte v Štokholme, kde sa zaoberá štúdiom úloh epigenetiky v centrálnom nervovom systéme.

Vo voľnom čase sa rád venuje lezeniu na skalách, cestovaniu a turistike.

Link na článok: https://www.nature.com/articles/s41587-021-00869-9

Popularizačný článok: https://news.ki.se/technique-allows-mapping-of-epigenetic-information-in-single-cells-at-scale

Rozhovor s Marekom pripravila Jana Laláková.

___

Viac informácií o Žijem vedu nájdete tu, na Facebooku na stránke Žijem vedu, na Twitteri, LinkedIne alebo Instagrame.